Результаты выполнения первого этапа мега-гранта ««Агропрепараты нового поколения: стратегия конструирования и реализация»
Результаты выполнения первого этапа мега-гранта ««Агропрепараты нового поколения: стратегия конструирования и реализация»
 
План НИР 2018 года выполнен полностью, все поставленные задачи решены. Получены следующие основные результаты:
 
Разработана эффективная технология синтеза разрушаемых полимеров с использованием нового и более доступного по сравнению с сахарами субстрата – глицерина (отхода производства биодизеля). Отобран и введен в культуру штамм Cupriavidus eutrophus B-10646, исследованы кинетические и продукционные характеристики штамма, обеспечивающего выходы полимера на глицерине, сопоставимые с процессом на сахарах. По новой технологии показана возможность в специализированных условиях углеродного питания синтеза полимеров различного состава с различным набором и соотношением мономеров. С применением ВЭЖХ, X-Ray, ДСК показано влияние типа и соотношения мономеров на направленность изменения молекулярно-массовых характеристик и степени кристалличности, которые составили у гомополимера П(3ГБ) 600-850 кДа и 65-80%, а у различных сополимерных образцов, соответственно, 250-350 кДа и 40-55% при неизменности температурных характеристик с сохранением разрыва между температурой плавления (150-178 оС) и термической деградации (261-296 оС). Организован процесс наработки партий полимеров в необходимых количествах.
 
Сформированы смеси с использованием П(3ГБ) и ПКЛ и ПЛ, а так же с природными материалами (глиной, торфом, березовыми опилками). Из смесей в виде сухих порошков и сырой пасты (влажность 40%) получены смесовые формы в виде гранул и прессованные 3D-формы; изучены их структура, физико-химические и механические свойства. Выполненный анализ ИК-спектров показал отсутствие образования химических связей между компонентами и механическом характере смесей, для которых характерны снижение температурных характеристик и пониженная степень кристалличности без изменения, включая ухудшение свойств полимеров.
 
Для конструирования долговременных форм отобраны системные препараты гербицидного и фунгицидного действия, относящиеся по строению и спектрам действия к различным классам, различной химической структуры, растворимости и стабильности впочве. Поставлены высокочувствительные методы детекции пестицидов газовой хроматографией (ГХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Для выбора типа ПГА в качестве основного компонента разрушаемой смесовой основы проведено сравнительное исследование кинетики разрушения полимеров различного строения в сконструированных лабораторных почвенных микроэкосистемах с агропреобразованной полевой почвой, которая запланирована для последующих полевых испытаний. По результатам отобран гомополимер П(3ГБ) как самый медленно разрушаемый, то есть пригодный для создания форм длительного действия. Сравнительное исследование влияния типа формы и способа изготовления (прессованием порошков, экструзией из расплавов, растворными технологиями) на интенсивность биодеградации и длительность функционирования в почве обосновало целесообразность применения форм, способных обеспечивать растения препаратами в течение вегетационного периода (от 1,5 до 3,0-х и более месяцев) двух методов – получение гранул из сырой пасты смесей полимера и наполнителя и холодного прессования порошков. На основе полученных результатов и их анализа сконструировано пионерное семейство пролонгированных препаратов гербицидного и фунгицидного действия для грунтового довсходового применения.
 
По результатам разработан Технологический регламент на конструирование сельскохозяйственных препаратов, депонированных в разрушаемую полимерную основу.
 
Исследование кинетики выхода действующих веществ в почву на фоне биоразрушения разработанных экспериментальных форм препаратов показало влияние на этот процесс геометрии формы (гранулы, 3D) и типа использованного пестицида. Исследовано влияние внесенных форм на структуру почвенного микробиоценоза, включая общий микробный титр, соотношение эколого-трофических групп и доминантных микроорганизмов. Впервые проведено выделение и идентификация деструкторов полимеров в смесях с различными природными и разрушаемыми синтетическими материалами. С применением молекулярно-генетических методов идентифицированы общие и специфические деструкторы для исследуемого набора образцов, среди которых 6 штаммов бактерий и 3 грибных штамма, фрагменты генов которых, соответственно, 16S рРНК и 28S рРНК депонированы в базе данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ под номерами MK300053-MK300061.
 
Более быстрое разрушение форм и, соответственно, выход препаратов характерны для гранулированных форм, характеризующихся низкой механической прочностью и меньшей сохранностью в почве, в отличии от более плотных и стабильных прессованных форм. Выход препаратов в значительной мере зависел от их растворимости, и был более активным для быстро растворимых (метрибузина, трибенурон-метила, метсульфурон-метила, дикамбы), в отличие от менее растворимых (феноксапроп-П-этила, тебуконазола, эпоксиконазола, азоксистробина, пендиметалина пропиконазола, карбендазима, беномила, тиабендазола). В целом, показано, что депонирование препаратов в разработанную полимерную основу с медленно разрушаемым П(3ГБ) и добавками использованных материалов обеспечивает не только длительное функционирование форм в почве (от полутора до трех и более месяцев), но и позволяет стабилизировать активность быстро инактивируемых препаратов (трибенурон-метила, метсульфурон-метила, феноксапроп-П-этила).
 
План НИР 2018 года выполнен полностью. Синтезированы и отобраны образцы разрушаемых полимеров и материалы, из которых получена смесовая основа различного состава; отобраны препараты гербицидного и фунгицидного действия, с использованием которых сконструировано пионерное семейство долговременных форм, пригодных для довсходового грунтового применения. Показано, что варьирование состава и геометрии основы и свойств гербицидов и фунгицидов (растворимости) позволяет создать формы с контролируемым выходом действующих веществ различной длительности функционирования в почве и, следовательно, с контролируемой доставкой действующих веществ растениям.
 
Для определения патентоспособности и патентной чистоты разрабатываемых препаратов проведены патентные исследования по теме проекта согласно ГОСТ Р 15.011-96, которые подтвердили научную значимость проекта и показали, что исследуемый объект содержит технические решения, соответствующие требованиям патентной чистоты.
 
Полученные результаты опубликованы в четырех статьях, в т.ч. три – в журналах первого квартиля. Организована и проведена на базе СФУ III-я Международная конференция «Биотехнология новых биоматериалов - окружающая среда – качество жизни».
 
Исполнители проекта приняли участие в серии международных научных форумов в основном с приглашенными докладами: 9th International conference «Biomaterials and nanobiomaterials: Recent Advances Safety – Toxicology and Ecology Issues», 06-13 May 2018 г., Ираклион, Греция; Международный конгресс «Биотехнологии: состояние и перспективы развития» « BioTech World», 23-25 Мая 2018 г., Россия, Москва; «International Symposium on Biopolymers» (ISBP – 2018) October 21st–24st 2018 г., Пекин, Китай; Международная научная конференция «The SGEM Vienna GREEN 2018», 3–6 декабря 2018 г., Хофбург, Австрия; 6th Int. Conference on Natural Polymers, Bio-Polymers, Bio-Materials, 7–9 декабря 2018, Коттаям, Индия.
 
Члены научного коллектива лаборатории прошли стажировки и повышение квалификации по теме научного исследования: в «Ассоциации инженеров по контролю микрозагрязнений» (АСИНКОМ) «Правила GMP. Техника чистых помещений», ООО «Био-Рус» «Инновационные решения для биотехнологии»; ООО «НПФ Синтол» на базе ФГБНУ ВНИИСБ «Анализ ГМО методом ПЦР в реальном времени в продуктах питания, продовольственном сырье, кормах и семенах».
 
За счет средств гранта приобретены оборудование, расходные материалы и реагенты в соответствии с планом 2018 г. Программа работ 2018 г. выполнена полностью. Подготовлены условия для реализации плана работ 2019 года.
 
Аннотированный полугодовой отчет за период январь-июнь 2018 г.

1.     Краткое описание выполненных работ за период январь-июнь 2018 г.
 
Согласно пунктам плана научного исследования на 2018 год, выполнены следующие работы:
 
1.1. Синтезированы и охарактеризованы партии разрушаемых полимеров (полигидроксиалканоатов, ПГА), различающиеся химическим составом и базовыми физико-химическими свойствами.
 
1.2. Разработано и исследовано семейство полимерных смесей на основе ПГА с материалами компаньонами и наполнителями в качестве разрушаемой основы для депонирования с/х препаратов.
 
1.3. Развернуты работы по конструированию пионерного семейства долговременных препаратов гербицидного и фунгицидного действия для грунтового довсходового применения депонированием в разрушаемую полимерную основу
 
2.1. Проводятся работы по изучению кинетики разрушения полимерной основы, выхода препаратов в почву в зависимости от структуры полимерной основы, типа и геометрии формы, степени нагруженности и химической структуры действующих веществ.
 
2.     Краткое описание полученных научных результатов
 
За отчетный период январь–июнь 2018 г. по проекту «Агропрепараты нового поколения: стратегия конструирования и реализация» получены следующие научные результаты:
 
1.1.     Синтез партий разрушаемых полимеров (полигидроксиалканоатов, ПГА), реализован, исходя из необходимости повышения их доступности и удешевления. Для этого избран подход расширения сырьевой базы и привлечения нового и более дешевого углеродного субстрата по сравнению с сахарами, так как затраты на С-субстрат составляют до 40-50% в общей структуре затрат на производство ПГА. Исследован глицерин, являющийся отходом производства биодизеля. Проведен скрининг коллекции штаммов, по результатам которого отобран штамм Cupriavidus eutrophus B-10646, наиболее продуктивный по общему выходу полимера и урожаю биомассы, сопоставимыми с показателями на сахарах. Установлены границы физиологического действия глицерина для исследуемого штамма; выявленные зоны лимитирования и ингибирования позволили рассчитать кинетические константы. Наработаны и охарактеризованы партии гомополимера 3-гидроксимасляной кислоты [П(3ГБ)]. .
 
При варьирование условий углеродного питания и режимов дозирования в питательную среду на основе глицерина прекурсоров мономеров 3-гидроксивалерата (3ГВ) и 4-гидроксибутирата (4ГБ) синтезировано семейство сополимерных ПГА с различным набором и соотношением мономеров, химический состав которых подтвержден хроматографией, совмещенной с масс-спектрометрией и снятыми 1Н-ЯМР спектрами. С применением ВЭЖХ, X-Ray, ДСК показана влияние типа и соотношения мономеров на направленность изменения молекулярно-массовых характеристик и степени кристалличности
 
1.2.     Для получения смесовой основы использован наиболее медленно разрушающийся полимер П(3ГБ), в качестве материалов компаньонов – синтетические разрушаемые полимеры: поликапролактон (ПКЛ); полилактид (ПМК); в качестве наполнителей (филеров): торф, древесные опилки, глина. Предварительно все компоненты измельчали для получения частиц близкого размера, которые далее смешивали с П(3ГБ). Из полученные смесей в виде сухих порошков и сырой пасты с применением гранулятора (Fimar, Италия) и полуавтоматизированного пресса Minipress (Минск) получены смесовые формы в виде гранул и прессованные 3D формы. С применением ИК-спектроскопии, ДСК, X-Ray, электронной микроскопии с системой микроанализа и рентгеноспектрального анализа исследованы все исходные материалы и полученные смеси. Анализ рентгенограмм и ИК-спектров свидетельствуют об отсутствии химических связей между компонентами и механическом характере смесей, для которых характерны снижение температурных характеристик и пониженная степень кристалличности, что говорит об изменении кинетики кристаллизации смесовых образцов.
 
1.3.     Развернуты работы по конструированию долговременных форм препаратов депонированием в смесовую полимерную основу, включающие выбор и постановку аналитических методов детекции действующих веществ препаратов и исследование особенностей разрушения полученных смесовых форм в почве. В качестве препаратов гербицидного действия исследованы: метрибузин, трибенурон-метил, метсульфурон-метил, пендиметалин, феноксапроп-П-этил, дикамба. В качестве препаратов фунгицидного действия исследованы тебуконазол, пропиконазол, карбендазим, беномил, тиабендазол, эпоксиконазол, азоксистробин. Исходя из необходимости применения специфических и высокочувствительных методов анализа, позволяющих детектировать концентрации пестицидов и их метаболиты на следовом уровне, а также в связи с тем, что действующие вещества в отобранных препаратах имеют разную химическую природу, использованы методы газовой (ГХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для детектирования концентраций действующих веществ построены калибровочные графики и определены линейные диапазоны концентраций. Для детектирования соединений методом ВЭЖХ построены аналогичные калибровочные графики также для концентраций (10–500 мкг/мл), исходя из литературных данных о максимумах поглощения детектируемых веществ.
 
2.1. Для исследования разрушения сконструированных форм препаратов разработаны лабораторные почвенные микрокосмы с охарактеризованными образцами агропреобразованной почвы, отобранной с полей полевого стационара «Миндерлинское» Красноярского аграрного университета (место предполагаемых полевых испытаний), в которой размещены исследуемые образцы, различающиеся геометрией и набором исходных компонентов (полимер-компаньон, полимер-филер). Охарактеризован химический состав и микробная составляющая исходной почвы. Длительность эксперимента – 3 месяца, его результатом станут исследованные закономерности кинетики разрушения смесовой основы в зависимости от набора исходных компонентов и геометрии формы. Начата подготовка к следующему эксперименту, в ходе которого сконструированные формы долговременных препаратов гербицидного и фунгицидного действия в течение 3-х месяцев будут экспонироваться в лабораторных почвенных микрокосмах для исследования влияния типа формы и препарата на кинетику выхода действующих веществ в почву на фоне разрушения полимерной основы с учетом динамики структуры почвенного микробиоценоза и выявления первичных микроорганизмов – деструкторов высокомолекулярной полимерной основы.
 
3. Результаты проекта были представлены на международных и РФ научных форумах и опубликованы в виде тезисов:
 
E.G. Kiselev, N.O. Zhila, T.G. Volova. Physicochemical properties of multicomponent polyhydroxyalkanoates: novel aspects// Abstract of 9th International conference “Biomaterials and nanobiomaterials: Recent Advances Safety - Toxicology and Ecology Issues". 06–13 May 2018. –Heraklion, Crete – Greece. 2018 – P.31.
 
Α. Demidenko, E. Kiselev, T. Volova. Production and characterization of PHA from biodiesel-glycerol by Cupriavidus eutrophus B10646 // Abstract of 9th International conference “Biomaterials and nanobiomaterials: Recent Advances Safety - Toxicology and Ecology Issues". 06-13 May 2018.- Heraklion, Crete – Greece. 2018 – P.38.
 
N. Zhila, O. Vinogradova. Properties of PHA bi-, ter-, and quarter-polymers containing 4-hydroxybutyrate monomer units // Abstract of 9th International conference “Biomaterials and nanobiomaterials: Recent Advances Safety - Toxicology and Ecology Issues". 06–13 May 2018. – Heraklion, Crete – Greece. 2018 – P.38.
 
Волова Т.Г., Жила Н.О., Киселев Е.Г., Шишацкая Е.И. Полигидроксиалканоаты – природные биоразрушаемые полимеры // Материалы Международного конгресса «Биотехнологии: состояние и перспективы развития» – BioTech World – 23–25 Мая 2018–Россия-Москва. 2018. – C. 737-738.
Филь А.А., Шмелькова В.Ю. Влияние модифицированных наноалмазов на взаимодействие гриба рода Trichoderma и растение //Материалы 56-й Международной научной студенческой конференции (МНСК-2018), 22-27 апреля, 2018. г. Новосибирск. – С. 188-189
 
© Сибирский федеральный университет, 2018 — 2019