Результаты выполнения второго этапа мега-гранта ««Агропрепараты нового поколения: стратегия конструирования и реализация» Завершен второй этап (2019) выполнения плана работ Лаборатории инновационных препаратов и материалов мега-гранта «Агропрепараты нового поколения: стратегия конструирования и реализация» Цель проекта – разработка научных основ конструирования экологически безопасных и эффективных форм препаратов для защиты культурных растений от сорняков и возбудителей болезней с адресным и контролируемым выходом активного начала за счет использования в качестве основы биоразрушаемых материалов. Планом отчетного 2019 года предусмотрено выполнение следующих НИР: исследование эффективности экспериментальных форм препаратов гербицидного и фунгицидного действия в лабораторных условиях в посевах зерновых и овощных культур, зараженных сорными растениями и фитопатогенами – возбудителями корневых гнилей; исследование последствий применения и механизма действия разработанных депонированных форм гербицидов с регистрацией массовости гибели сорняков, цитогенетических исследований изменений кариотипа корневой меристемы, функциональной активности фотосинтетического аппарата и нарушений в синтезе хлорофилл-белковых комплексов; исследование механизма повреждающего действия возбудителей корневых гнилей и фитотоксичности фунгицидных препаратов в зависимости от формы доставки по степени поражения корневой системы с регистрацией состояния корневых апексов, продуктов окислительного стресса, активности антиоксидантных и защитных систем растений. План НИР 2019 года выполнен полностью.
Получены следующие основные результаты:
В ходе тестирования исследуемых гербицидов установлено, что в свободной форме в виде растворов МЕТ, ТРИБ и ФЕН, независимо от механизма их действия, ингибируют развитие сорных, а также нетаргетных зерновых и овощным культур на ранней стадии формирования проростков, а также при длительном выращивании в почвенной культуре. Действие свободных и депонированных форм МЕТ и ТРИБ выполнено в индивидуальных посевах повсеместно распространенных и засоряющих сельскохозяйственные культуры сорных растениях: щирицы запрокинутой (Amaranthus retroflexus), горчицы полевой (Sinapis arvensis), нивяника (Leucanthemum maximum); гулявника Лезеля (Sisymbrium loeselii), эльсгольции реснитчатой (Elsholtzia ciliata), овсюга обыкновенного (Avena Fatula L.), щетинника-лисий хвост (Setaria macrocheata), а также в почвах яровой пшеницы «Новосибирская 15» и ячменя «Биом», зараженных сорняками. Установлено, что биологическая эффективность депонированного метрибузина сопоставима с его свободной формой и составила 100 % (полная гибель всех сорняков) на 21 суточных растениях. Биологическая эффективность депонированного ТРИБ была несколько ниже депонированного МЕТ и составила в сроки 28 суток 100 % только по отношению к эльсгольции; 97,1 и 74,6 %, соответственно, для щирицы и гулявника; 63–70 % для нивяника и горчицы. При этом показано, что гербицидная активность свободной формы ТРИБ уступает депонированной; это проявлялось на более поздних сроках наступления массовой гибели сорняков, что можно связать с известными данными о том, что этот гербицид активно метаболизируется в тканях высших растений до нетоксичных для них продуктов. Поэтому весьма важным является показанная возможность усилить его действие в результате депонирования. Таким образом, депонирование исследованных гербицидов в разработанную разрушаемую основу на основе П(3ГБ) не только не снижает их активности по отношению ко многим сорным растениям, но также и усиливает их действие. Эффективность разработанных депонированных форм МЕТ и ТРИБ исследована в микрополевых экспериментах в условиях полевого стационара Красноярского государственного агроуниверситета в культурах свеклы столовой сорт «Цилиндра» и томатов «Загадка» с высоким уровнем засоренности участка сорными растениями различных видов. Наиболее эффективной оказалась экспериментальная форма депонированного МЕТ, практически полностью подавляющая развитие сорняков, что привело к наиболее высоким урожаям плодов томатов (2,3 кг/м2), это выше более, чем в 2 раза по сравнению со свободным МЕТ и двумя формами ТРИБ; свеклы (3,4 кг/м2), это выше отрицательного контроля и свободных гербицидов в 1,2 раза. Исследование последствий и механизма действия МЕТ и ТРИБ показало, что гербициды обладают таргетной активностью в отношении сорных растений (Sinapis arvensis L., Amaranthus retroflexus L., Avena Fatula L.), а также негаргетных зерновых (пшеница, ячмень) и овощных (томаты, свекла столовая) культур, вызывая снижение митотического индекса клеток апикальной меристемы и увеличение клеток с различными аномалиями. Действие МЕТ и ТРИБ на сорные растения, независимо от формы доставки (свободные или депонированные), вызывает изменения распределения клеток по фазам, что в конечном итоге приводит к ингибированию пролиферации клеток и снижению активности роста корней. Исследование генотоксичности свободных и депонированных гербицидов выявило структурные аномалии (мутации), обусловленные разрывами хромосом (мосты, фрагменты, микроядра) – кластогенные эффекты, и нарушения, обусловленные повреждением веретена деления (отстающие хромосомы и их фрагменты, неравномерное расхождение хромосом) – анеугенные эффекты, выраженность которых под действием свободной и депонированных форм гербицидов была сопоставимой. Оценка фотосинтетической активности растений с использованием параметров флуоресценции (Y(II)max, ETRmax,Y(NPQ)) на серии сорных растений различных видов показала, что на повреждения фотосинтетического аппарата и содержание хлорофилл-белковых комплексов влияет тип гербицида и форма его доставки, а также проявляется в зависимости от вида растений. Результаты свидетельствуют о мощном ингибирующем действии обеих форм МЕТ (свободного и депонированного) на фотосинтетический аппарат всех исследуемых сорняков, вызывая снижение параметров флуоресценции, характеризующих ключевые реакции фотосинтеза (Y(II)max и ETRmax) от 8–10 раз и более по сравнению с отрицательным контролем; ингибирование реакций транспорта электронов фотосистемы-2(ФС2) блокировало фотохимическое использование растениями поглощенной энергии света и замедляло все процессы фотосинтеза, вплоть до полной их остановки. При исследовании влияния свободной и депонированных форм ТРИБ в отличии от МЕТ получена неоднозначная картина ответа и динамики показателей фотосинтетической активности у сорных растений различных видов. Показано, что свободная форма ТРИБ вызывает наиболее выраженное ингибирование параметров флуоресценции у большинства растений на ранних стадиях эксперимента, но в дальнейшем, как правило, снижается в отличии от депонированного гербицида, действие которого возрастает во времени, достигая более сильного эффекта, чем свободный ТРИБ. Депонированный ТРИБ в отличии от свободного характеризуется пролонгированным эффектом в связи с его постепенным высвобождением из полимерной основы, что обусловлено достаточно медленной деградацией П(3ГБ). В целом, детектируемые параметры флуоресценции хлорофилла показали их безусловную полезность в качестве индикатора повреждающего фотосинтетическую деятельность растений под действием различных гербицидов. Установлено, что разработанные формы системных фунгицидов тебуконазола (ТЕБ), эпоксиконазола (ЭПОК) и азоксистробина (АЗО), независимо от геометрии и наполнителя полимерной основы (торф, глина, опилки), обладают выраженным ингибирующим действием в отношении фитопатогена Fusarium verticillioides, эффективно подавляя развитие колоний гриба. Исследование антифунгальной активности свободных и пролонгированных препаратов в посевах зерновых, зараженных возбудителями корневых гнилей, показало, что при использовании свободных фунгицидов эффект подавления фузариоза имеет место на стадии 7-ми дневных растений в отличии от депонированных форм, в случае которых эффект нарастает во времени, что связано с постепенным выходом препаратов из полимерной основы и необходимостью времени для накопления фунгицидов в почве, это приводит к повышению активности в 1,5 раз и более по сравнению с ослабевающим действием однократно внесенных свободных фунгицидов. Более активное подавление фитопатогенов в ризосфере зерновых депонированными фунгицидами приводит к эффективному оздоровлению корней пшеницы и ячменя и более высоким показателям стеблестоя и продуктивности по зеленой биомассе. Исследование механизма повреждающего действия фитопатогенов – возбудителей корневых гнилей и фитотоксичности фунгицидных препаратов в зависимости от формы доставки в ходе анализа поражения корневой системы с регистрацией состояния корневых апексов по данным РЭМ позволило выявить существенно различающиеся морфотипы ризосферного пространства вокруг апексов и их зависимость от типа фунгицидов и степени инвазии корней фитопатогенами. Для инфицированных растений характерно увеличение в корневом апексе численности пограничных клеток (ПК) и размеров гелевого чехла за счет многократного повышения секреторной активности клеток, что является проявлением защитных реакций растений. Негативное действие фунгицидов вызывает значительные нарушения структуры корневых апексов корней зерновых вплоть до полного их разрушения. Сопоставление действия свободных и депонированных фунгицидов ТЕБ и ЭПОК на активность антиоксидантных и защитных систем пшеницы и ячменя дало весьма сложную картину и показало, что синтез и выделение корневой системой растений продуктов перекисного окисления белков и мембранных липидов (соответственно, карбонилированных белков (КБ) и малонового альдегида (МБА)) и пролина (интегрального показателя антиоксидантных и защитных систем растений) зависит не только от типа фунгицида и формы его доставки, но также от вида растений и их возраста. Показано, что депонированные формы фунгицидов, несколько по разному влияя на развитие окислительного стресса у пшеницы и ячменя, в целом, имея постепенное и нарастающее во времени более активное подавление фитопатогенов, в большинстве случаев позитивно влияют на способность растения мобилизовать свои защитные системы в ответ на воздействие негативных факторов. Выполненные многоцентровые исследования свидетельствуют о том, что разработанные формы гербицидов и фунгицидов за счет депонирования в основу из разрушаемого биоматериала поли-3-гидроксибутирата эффективны при довсходовом грунтовом применении в культурах зерновых и овощных растений, зараженных сорняками различных видов и фитопатогенами, вызывающими развитие корневых гнилей. Полученные результаты опубликованы в 8 статьях, включая 6 - в импактовых журналах, индексируемых в WoS, в т.ч. 4 - в журналах первого квартиля и монографии «New Generation Formulations of Agrochemicals: Current Trends and Future Priorities», изданной в Канаде в издательстве CRC/Taylor&Francis:Appl. Acad. Press. Исполнителем проекта А.В. Демиденко защищена кандидатская диссертация по специальности биотехнология «Технология биосинтеза полигидроксиалканоатов на глицерине и реализация опытного производства» (результаты НИР плана проекта 2018 г.). Исполнители проекта провели рабочее совещание «Агропрепараты нового поколения: стратегия конструирования и реализация", Красноярск – июль - 2019; приняли участие в организации и проведении 10-й Международной конференции «Biomaterials and nanobiomaterials»: май 2019-Ираклион, Греция; приняли участие в серии международных научных форумов (в основном с приглашенными докладами): 10th Международной конференции «Biomaterials and nanobiomaterials: «Recent Advances Safety – Toxicology and Ecology Issues», 2019. – Греция; 33-й Международной конференции группы деградации полимеров Королевского общества по химии Великобритании – (PDDG) 33rd Polymer Degradation and Stability) – 2019. – Мальта; Международной конференции «The SGEM Vienna GREEN 2019», Хофбург, Австрия; 7th Int. Conference on Natural Polymers, Bio-Polymers, Bio-Materials, Коттаям, Индия, а также в серии важных совещаний, организованных крупнейшими нефтеперерабатывающими компаниями России (ПАО «СИБУР Холдинг» и ОАО «Татнефтехиминвест-холдинг») по перспективам создания производства и применения в России разрушаемых «зеленых» биопластиков. Сотрудники Лаборатории прошли стажировки и курсы повышения квалификации по теме научного исследования в ФГБНУ "Всероссийский НИИ защиты растений", г. Санкт-Петербург по программе «Биоразнообразие и идентификация возбудителей болезней растений»; в ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Министерства здравоохранения РФ по программе «Актуальные регуляторные требования к организации фармацевтической системы качества. Практические рекомендации с учетом подготовки к прохождению аудитов/инспекций на соответствие требований GMP»; в СФУ (Красноярск) – программа дополнительного профессионального образования «Патентоспособные решения – основа безопасного бизнеса». Программа работ 2019 г. выполнена полностью.