Планом отчетного 2021 года предусмотрено выполнение следующих задач: Анализ литературы и выбор фунгицидных препаратов, пригодных для депонирования и защиты картофеля при грунтовом применении; синтез партий разрушаемых полимеров; формирование смесей «полимер/природный материал-наполнитель»; конструирование долговременных фунгицидных препаратов; исследование кинетики биоразрушения депонированных фунгицидов в почве и выхода действующих веществ; выделение и идентификация автохтонных возбудителей болезней картофеля; тестирование биологической активности депонированных фунгицидов in vitro в культурах возбудителей болезней картофеля; оценка возможности предпосадочного нанесения на клубни пленочного полимерного покрытия с фунгицидами; исследование эффективности действия депонированных фунгицидов в вегетационных микрополевых опытах в посадках картофеля. В процессе реализации плана НИР 2021 года проведены комплексные исследования, которые обеспечили выполнение НИР и решение всех сформулированных задач. Получены следующие основные результаты: Выполненный анализ литературных источников, баз данных и сайтов ведущих производителей пестицидов показал актуальность и настоятельную потребность необходимости применения экологически безопасных пестицидных препаратов нового поколения, а также новизну и оригинальность подхода исполнителей проекта в части создания пролонгированных фунгицидных препаратов с применением разрушаемых полимеров микробиологического происхождения (полигидроксиалканоатов, ПГА). На основе выполненного анализа литературы отобраны и приобретены фунгициды для конструирования депонированных фунгицидов с целью защиты картофеля от наиболее распространенных и вредоносных возбудителей болезней. Это разрешенные для применения в РФ контактно-системные фунгициды с различным механизмом действия: азоксистробин (фунгицид из класса стробилуринов; дифеноконазол (фунгицид из класса производных триазола); Мефеноксам (фунгицид из класса фениламидов); протиоконазол (фунгицид из класса производных триазола). В качестве сравнения для групп положительного контроля использованы коммерческие аналоги: «Квадрис», «Скор», «Юниформ». С учетом химической структуры препаратов поставлены методы детектирования высокоэффективной жидкостной хроматографией с использованием соответствующих методических указаний для азоксистробина, дифеноконазола, мефеноксама, позволяющие детектировать их содержание в широком диапазоне концентраций (от 0,5 до 1000 мкг/мл). Для конструирования депонированных фунгицидов произведена наработка партий наиболее медленно разрушающегося полимера (поли-3-гидроксибутирата (П(3ГБ))) по технологии, разработанной в рамках проекта с использованием в качестве С-субстрата глицерина, снижающего затраты на синтез полимеров, в количестве 12 кг; произведена очистка до получения гомогенных образцов; исследованы физико-химические свойства (средневесовая молекулярная масса составила в партиях 910 ± 20 кДа с полидисперсностью 2,48 ± 0,3; температура плавления и термической деградации, соответственно, 169,5 ± 0,5 °С и 280 ± 2 °С; степень кристалличности 77% ± 1%). Из сформированных порошковых смесей по разработанной и запатентованной технологии (патент РФ № 2733295) сконструированы партии депонированных фунгицидов в виде гранул, различающихся размерами (диаметр 1,5 и 3,0 мм; масса 4-5 и 8-10 мг) с соотношением компонентов П(3ГБ):опилки:фунгицид = 60 : 30 : 10 (при депонировании одного фунгицида – азоксистробина, дифеноконазола, мефеноксама, или протиоконазола) и 60 : 30 : 5 : 5 (вес.%) (при депонировании комплекса азоксистробин+ мефеноксам). Получено 10 вариантов депонированных фунгицидов. С применением ИК-спектроскопии, ДСК, РЭМ и X-Ray исследованы исходные материалы (полимер, древесные опилки и фунгициды) и полученные формы. Доказано отсутствие образования новых химических связей между компонентами, что является свидетельством механического характера смешения разрушаемой основы и пестицидов и отсутствия негативного влияния процесса смешения и депонирования в основу (полимер/опилки) на исходные физико-химические свойства, как полимерной основы, так и пестицидов. Показано, что все типы депонированных фунгицидов представляют собой долговременные формы с периодом полураспада от 100 до 120 суток, соответственно, для гранул с диаметром 1,5 и 3,0 мм. На разрушаемость гранул, помимо их размера, влияла структура фунгицидов, имеющих различную растворимость, в зависимости от которой остаточная масса гранул за наблюдаемый период (5 месяцев) составила для больших гранул от исходных значений от 33-46% до 60%; для малых гранул несколько меньше, от 30-40% до 55-58%. Все типы гранул обладали антифунгальным действием и подавляли развитие фитопатогенов Fusarium и Alternaria, титр которых был ниже порога обнаружения, что свидетельствует о высокой биологической активности разработанных форм. Депонированные дифеноконазол и комплекс азоксистробин+мефеноксам были наиболее результативными, снижая многократно общую численность исследованных микромицетов по сравнению с их содержанием в интактной почве. В рамках задачи выделения и идентификации автохтонных возбудителей болезней картофеля, распространенных в Красноярском крае (Восточно-Сибирский экономический район Центральной и Восточной Сибири) в ходе фитосанитарного анализа почвы и семенного материала картофеля в чистые культуры выделена серия изолятов, отнесенных к Fusarium, Alternaria, Boeremia, Rhizoctonia. С использованием морфологических, культуральных и молекулярно-генетических методов, включая полученные нуклеотидные последовательности фрагмента гена 28S рРНК (депонированы в базе данных GenBank под номерами №№ MZ424190-MZ424198), идентифицированы следующие патогены : Alternaria alternata, Alternaria longipes, Phytophthora infestan, Boeremia exigua, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Fusarium redolens, Fusarium solani, Fusarium equiseti, Fusarium vanettenii. Филогенетический и молекулярный эволюционный анализ идентифицированных автохтонных возбудителей болезней при сравнении с последовательностями в GenBank веб-ресурса NCBI показал, что микроорганизмы формируют на дереве с максимальным уровнем «bootstrap»-поддержки три отдельных кластера : первый монофилетический содержит штаммы вида Phytophthora infestans; второй кластер также монофилетический содержит вид Rhizoctonia solani; третий кластер содержит виды родов Fusarium, Alternaria и Boeremia. Тестирование биологической активности депонированных фунгицидов диско-диффузионным методом in vitro в культурах фитопатогенных грибов (Alternaria alternata, Alternaria longipes, Boeremia exigua, Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Fusarium redolens, Fusarium solani, Fusarium equiseti, Fusarium vanettenii) показало, что все разработанные формы обладают выраженным ингибирующим действием, сопоставимым со свободными фунгицидами и коммерческими аналогами. Наиболее активно (в 2,0-2,3 раза относительно интактных образцов) ингибирование роста колоний под действием депонированных фунгицидов проявлялось по отношению к наиболее вредоносным патогенам картофеля P. infestans, A. longipes, B. exigua, R. solani и F. solani.
Исследование биологической активности депонированных форм фунгицидов в сравнение с их коммерческими аналогами, выполненное в лабораторной фитотронной культуре картофеля, подтвердило наличие высокой антифунгальной активности разработанных форм. В экспериментальных группах появление всходов и полные всходы картофеля зафиксированы на 5 суток ранее групп сравнения; высота экспериментальных растений была в 1,6-2,0 раза выше в ходе вегетации, а зараженность ризосферы и клубней ниже. Масса клубней, полученных с одного экспериментального растения, была самой высокой с депонированным азоксистробином и комплексом азоксистробин+мефеноксам, превышая показатели коммерческих аналогов, соответственно, в 1,6 и 1,7 раз; наибольшая прибавка урожая в этих экспериментальных группах превысила показатели контроля на 60% и 71,3% соответственно. Показана возможность формирования на клубнях прочного покрытия определенной толщины из полимерных растворов заданной плотности без повреждения поверхности клубней и снижения всхожести. Покрытие, сформированное из 1% раствора П(3ГБ) и содержащее азоксистробин, разрушилосьв почве практически полностью в течение 35 суток, обеспечив снижение зараженности картофеля до 8,6% в сравнение с предпосевным протравливанием клубней (12,1%) и положительно влияло на количество товарных клубней (50%) и урожайность (24,0 ± 2,9 т/га), что выше контроля (35% и 18,4 ± 2,2 т/га соответственно). Масштабированные испытания в микрополевых условиях на двух сортах картофеля «Красноярский ранний» и «Леди Клэр» подтвердили наличие пролонгированного антифунгального эффекта у депонированных пестицидов, несмотря на неоптимальные погодные условия, сдерживающие развитие и активность почвенной микрофлоры – главного фактора деградации форм и выхода действующих веществ в почву. В борьбе с альтернариозом в посадках картофеля обоих сортов эффективны депонированные азоксистробин, дифеноконазол и, в особенности, комплекс азоксистробин+мефеноксам. Для подавления фитофтороза на сорте «Красноярский ранний» эффективны депонированные азоксистробин и азоксистробин+мефеноксам; на сорте «Леди Клэр» – депонированный азоксистробин. Все депонированные фунгициды позитивно влияли на качество клубней, снижая поражение ризоктониозом, исследованными видами парши и фитофторозом. Применение депонированных фунгицидов повышало урожайность картофеля наиболее значительно (на 12,9 и 32,7%), соответственно, у сорта «Красноярский ранний» и «Леди Клэр» при использовании комплекса азоксистробин+мефеноксам, обладающего наиболее высокой антифунгальной активностью. Полученные результаты опубликованы в 9 статьях в международных импактовых журналах, включая три статьи категории Q1 и три Q2; в главе коллективной международной монографии «Emerging Trends in Polymeric Materials’, Synthesis, Application, and Characterization» CRC/Taylor&Francis : Appl. Acad. Press. Проведена на базе СФУ IV-я Международная конференция «Биотехнология новых биоматериалов – окружающая среда – качество жизни». Исполнители проекта приняли участие в серии международных научных форумов : на Международной арктической конференции (МАК 8+) (Норильский государственный индустриальный Институт, 07- 09 апреля 2021); в лектории общероссийской просветительской акции «На острие науки» (28 марта 2021 г., Сочи, РФ); International Online Conference on Macromolecules : Synthesis, Morphology, Processing, Structure, Properties and Applications (ICM-2021) (10-12 September 2021 at Mahatma Gandhi University, Kottayam, Kerala, India); на Международном конгрессе «Biomaterials and Nano-biomaterials : Recent Advances Safety – Toxicology and Ecology Issues» (27.10.21-04.11.21, Ираклион, Греция); на II Международной научной конференции «Экосистемы без границ – 2021» (06–07.10.21, Калининград, Россия); International Online Conference on Materials Science and Technology (ICMT 2021) (2-14 November 2021 at Mahatma Gandhi University, Kottayam, Kerala, India); на VI Всероссийском молодежном научном форуме «Наука будущего молодых» (17-20 ноября, Москва); Молодежном научном конгресс 8-10 декабря 2021, Сочи-Сириус. Научная молодежь приняла участие в ряде научных форумов : научной сессии молодежи ФИЦ КНЦ СО РАН; XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Проспект Свободный – 2021»; XXVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2021», Москва – МГУ (заочно); молодежном научном конгрессе 8-10 декабря, Сочи-Сириус. Аспирантки О. Петровская и Н. Стрельцова – стали победителями конкурса научных работ «Бай Стади» получения именных стипендий агроинвестора корпорации Bayer Crop Science; А. Владимирова выиграла грант Всероссийского конкурса молодёжных инновационных проектов «УМНИК». Исполнители проекта прошли курсы повышения квалификации в НОЦ «Институт непрерывного образования» ФГАОУ ВО Сибирский федеральный университет : по дополнительной образовательной программе «Корпоративные сервисы СФУ»; по программам «Анализ данных в R» и «Разработка электронных курсов в системе LMS Moodle»; а также прошли обучение в режиме вебинара : «Diverse Applications of Nanostructured Materials», организованного Department of Nanoscience and Technology and SREC Innovation Incubation Foundation, Sri Ramakrishna Engineering College, Vattamalaipalayam, Coimbatore; «Publish not perish, или как не погибнуть при публикации»; «Система «Антиплагиат» в помощь автору научных публикаций»; «Ресурсы Clarivate для авторов», организованном «Сlarivate» Web of Science. Аспиранты А. Е. Дудаев и Н. В. Стрельцова прошли месячную стажировку на базе Университета Махатмы Ганди (Керала, Индия) в период 14.11-14.12. 2021 г. За счет средств гранта приобретены химические реактивы для аналитики, создания композитных материалов, синтеза и выделения полимеров; приборы и оборудование , включая : гомогенизатор Ultra-Turrax T 25 digital; лабораторный экструдер SJ-28; люминометр System SURE Plus; инкубатор BINDER BD 260; весы Adventurer AX124 и SPX223, НПВ 220 г; сухожаровой шкаф; ванна ультразвуковая «Сапфир» ТТЦ; аспиратор ПУ-1Б; комплект оборудования для анализа по Кьельдалю на базе АКВ-20. Программа работ 2021 г. выполнена полностью. Подготовлены условия для реализации плана работ 2022 года.